Early determination of gender by analysis of fetal DNA in maternal plasma

Ciro Dresch Martinhago1, Ricardo Manoel de Oliveira2, Maria do Carmo Tomitão Canas3, Laura Diniz Vagnini4,
João Batista Alcantara Oliveira5, Claudia Guilhermino Petersen6, José Gonçalves Franco Junior

RESUMO
Objetivo: avaliar a possibilidade do diagnóstico precoce do sexo fetal no plasma materno pela técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) a partir da 5ª semana de gestação. Métodos: nesse estudo prospectivo foi coletado sangue periférico de gestantes com feto único a partir da 5ª semana de gestação. Após centrifugação do sangue, 0,4 mL de plasma foi separado para extração de DNA fetal. O DNA foi analisado em duplicata por PCR em tempo real para duas regiões genômicas (uma do cromossomo Y e outra comum a ambos os sexos) pelo método de TaqMan®,o qual utiliza um par de primers e uma sonda fluorescente. Foram excluídos da amostragem os casos que evoluíram para aborto. Para o cálculo da sensibilidade e especificidade, usamos o método de comparação com padrão-ouro, que foi o sexo ao nascimento. Resultados: foram realizados 79 exames de DNA fetal no plasma materno de 52 gestantes. O resultado dos exames foi comparado com o sexo da criança após o parto. O índice de acerto conforme a idade gestacional foi de 92,6% (25 de 27 casos) na 5ª semana, conferindo sensibilidade de 87% e 95,6% (22 de 23 casos) na 6ª semana, com sensibilidade de 92%. A partir da 7ª semana de gestação o acerto foi em 100% (29 de 29 casos). A especificidade foi de 100% independente da idade gestacional. Conclusões: a técnica de PCR em tempo real para detecção do sexo fetal a partir da 5ª semana no plasma materno possui boa sensibilidade e excelente especificidade. Houve concordância do resultado em 100% dos casos em que o diagnóstico foi masculino, independente da idade gestacional, e no caso de feminino, a partir da 7ª semana de gestação.
 
PALAVRAS-CHAVE: Determinação do sexo (Análise); Reação em cadeia da polimerase/métodos; Diagnóstico pré-natal;
Idade gestacional
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ABSTRACT
Purpose: to verify the viability of early diagnosis of fetal gender in maternal plasma by the real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) starting at the 5th week of pregnancy. Methods: peripheral blood was collected from pregnant women with single fetus starting at the 5th week of gestation. After centrifugation, 0.4 mL plasma was separated for fetal DNA extraction. The DNA was analyzed in duplicate by real-time PCR for two genomic regions, one of the Y chromosome and the other common to both sexes, through the TaqMan® method, which uses a pair of primers and a fluorescent probe. Patients who aborted were excluded. Results: a total of 79 determinations of fetal DNA in maternal plasma were performed in 52 pregnant women. The results of the determinations were compared to fetal gender after delivery. Accuracy according to gestational age was 92.6% (25 of 27 cases) at 5 weeks with 87% sensitivity, and 95.6% (22 of 23 cases) at 6 weeks with 92% sensitivity. Starting at the 7th week of pregnancy, accuracy was 100% (29 of 29 cases). Specificity was 100% regardless of gestational age. Conclusion: real-time PCR for the detection of fetal gender in maternal plasma starting at the 5th week of gestation has good sensitivity and excellent specificity. There was agreement of the results in 100% of the cases in which male gender was diagnosed, regardless of gestational age, and from the 7th week of gestation for female gender diagnosis.
 
KEYWORDS: Sex determination (Analysis); Polymerase chain reaction/methods; Pre-natal diagnosis; Gestational age
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Recebido em: 6/12/2005 Aceito com modificações em: 31/3/2006
Determinação precoce do sexo fetal pela análise do DNA no plasma materno
Early determination of gender by analysis of fetal DNA in maternal plasma
Ciro Dresch Martinhago1, Ricardo Manoel de Oliveira2, Maria do Carmo Tomitão Canas3, Laura Diniz Vagnini4,
João Batista Alcantara Oliveira5, Claudia Guilhermino Petersen6, José Gonçalves Franco Junior7
Trabalho realizado no Centro Paulista de Diagnóstico e Pesquisa – CPDP – Ribeirão Preto (SP) – Brasil
1 Médico geneticista do CPDP – Centro Paulista de Diagnóstico e Pesquisa – Ribeirão Preto (SP) – Brasil; Doutorando do Programa de Pós-Graduação em
Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia da Faculdade de Medicina de Botucatu – Universidade Estadual Paulista “Julio Mesquita Filho” – UNESP –
Botucatu (SP) – Brasil.
2 Diretor da Clínica Ciro Martinhago Medicina Genômica – São Paulo (SP) – Brasil.
3 Bióloga do CPDP – Centro Paulista de Diagnóstico e Pesquisa – Ribeirão Preto (SP), Brasil.
4 Bioquímica do CPDP – Centro Paulista de Diagnóstico e Pesquisa – Ribeirão Preto (SP), Brasil.
5 Médico do Centro de Reprodução Humana – Prof. Franco Junior – Ribeirão Preto (SP), Brasil.
6 Embriologista do Centro de Reprodução Humana – Prof. Franco Junior – Ribeirão Preto (SP), Brasil.
7 Diretor do Centro de Reprodução Humana – Prof. Franco Junior – Ribeirão Preto (SP), Brasil.
Correspondência: José Gonçalves Franco Junior
Av. Professor João Fiusa, 689 – Alto da Boa Vista – 14025-310 – Ribeirão Preto – SP – e-mail: [email protected] / [email protected]
 
Introdução
Desde 19661, com a demonstração de que a constituição cromossômica de um feto podia ser determinada pela análise da cultura das células do líquido amniótico, o diagnóstico pré-natal vem despertando grande interesse da comunidade médica. Após quase 40 anos, grandes avanços na área de diagnóstico pré-natal têm sido alcança- dos, e cada vez mais se estudam métodos não invasivos que propiciem o diagnóstico precoce de distúrbios fetais. Na área da biologia molecular já é possível o diagnóstico de inúmeros distúrbios genéticos, sejam herdados ou não2-5. A passagem de células fetais para o sangue materno é fenômeno bem conhecido, e já se ima- ginava que essa fonte de material fetal poderia ser ferramenta para detecção de anormalidades relacionadas ao feto6. Em 1997, foi descrita pela primeira vez a presença de DNA fetal no plasma e soro maternos7. No mesmo trabalho se destaca a importância do achado de uma fonte de material fetal no sangue materno, com possível aplicação como exame diagnóstico não invasivo de distúr- bios fetais como as cromossomopatias (aneuploi- dias fetais), distúrbios genéticos herdados pater- nalmente ou de algumas doenças genéticas com modo de herança autossômica recessiva. Na oca- sião, a detecção do DNA fetal foi confirmada pela presença de uma região do cromossomo Y. As ges- tantes com um feto do sexo masculino apresenta- vam o exame positivo. Já na gravidez com feto fe- minino os exames eram negativos. Aproximada- mente um ano depois, os mesmos pesquisadores conseguiram quantificar o DNA fetal em relação ao DNA materno, por meio de nova tecnologia em biologia molecular com a reação em cadeia da po- limerase em tempo real (PCR em tempo real)8. Do plasma das gestantes foi extraído o DNA fetal, sendo analisado em PCR por meio da identificação de duas regiões genômicas, uma no cromossomo Y e outra em região comum para os cromossomos X e Y denominada de beta-globina. A amplificação da região da beta-globina serve como controle positi- vo da reação, já a região do cromossomo Y é detec- tada apenas quando o feto é do sexo masculino. O diagnóstico do feto do sexo feminino é feito por exclusão. A metodologia aplicada para se quantifi- car o DNA fetal foi efetuada por meio de “curva padrão”, na qual se usa um DNA de feto do sexo masculino e, a partir desse, fazem-se diluições que no caso do trabalho foram de 1.000 até uma única cópia do cromossomo Y8. Portanto, em cada reação foram usadas essas curvas-padrão versus o DNA extraído do plasma das gestantes com a sub-seqüente quantificação. Além disso, os autores con- seguiram demonstrar que no primeiro e segundo trimestres de gestação, o DNA fetal corresponde a uma concentração em média de 3,4% de todo o DNA presente no plasma, já no terceiro trimestre de gestação essa concentração chega a 6,2%8,9. Recentemente, foi demonstrado que mulhe- res gestando fetos com aneuploidia, principalmen- te a trissomia do cromossomo 21 (síndrome de Down) ou do cromossomo 13 (síndrome de Patau), apresentavam concentração de DNA fetal muito maior que as mulheres que gestavam fetos sem o mesmo distúrbio10-12. Contudo, esses dados são pre- liminares, pois o número de amostras ainda é pe- queno. Atualmente, usando-se a técnica de PCR em tempo real, a grande maioria dos trabalhos tem mostrado sensibilidade e especificidade de 100% para o diagnóstico do sexo fetal no primeiro tri- mestre de gestação13-16. Esses trabalhos, porém, priorizaram a detecção do DNA fetal a partir da 7ª semana de gestação, havendo dúvida se seria pos- sível a detecção em idades gestacionais mais pre- coces. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade do diagnóstico precoce do sexo fetal no plasma materno pela técnica de PCR em tempo real, a partir da 5ª semana de gestação.
 
Métodos
Nesse estudo prospectivo foram incluídas gestantes a partir da 5ª semana que engravidaram de feto único por meio de fertilização in vitro no Centro de Reprodução Humana Prof. Franco Junior. Após esclarecimentos sobre a pesquisa, as gestantes interessadas em participar assinaram termo de consentimento livre e esclarecido, o qual foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP). O sexo fetal determinado foi confirmado junto aos pais após o nascimento da criança. A metodologia envolveu a coleta de 10 mL de sangue periférico materno em tubos contendo o anticoagulante EDTA e centrifugados para a separação do plasma. O plasma obtido foi colocado em tubo de PCR e congelado à temperatura de -20ºC. Caso a manipulação imediata do plasma não fosse possível, as amostras seriam estocadas em geladeira por no máximo 48 horas. Posteriormente, os tubos de PCR contendo o plasma materno foram centrifugados novamente e todo o material sobrenadante foi então colocado em novos tubos de PCR, dos quais foi retirado 0,4 mL para extrair o DNA fetal. A extração de DNA foi realizada por meio de kit comercial (QIAamp Blood Mini Kit – Qiagen, GmbH, Alemanha) com protocolo sugerido pelo fabricante. Todo o processo foi executado por indivíduo do sexo feminino para evitar possíveis contaminações exógenas com DNA masculino. As reações foram realizadas em máquina de PCR em tempo real (7500 Real Time PCR System – Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando o sistema TaqMan® para detecção do produto de amplificação. O princípio do sistema utilizado na PCR em tempo real consistiu na combinação de um termociclador com a detecção de fluorescência emitida em cada ciclo. O método de TaqMan® utiliza uma sonda marcada com uma molécula fluorescente (fluoróforo) e outra de apagamento intramolecular (quencher) além do par de oligos iniciadores (primers) que se utilizam na PCR comum. A sonda é constituída de uma seqüênciaalvo que está entre os dois oligos iniciadores. Enquanto a sonda está livre em solução, o fluoróforo e o quencher que ficam nas extremidades da sonda só emitem sinal quando são separados por meio da clivagem da sonda pela enzima Taq®DNA polimerase durante a reação. Portanto, durante a reação, quando as sondas se ligam na seqüência-alvo, o fluoróforo e o quencher são separados, e a fluorescência pode ser mensurada pela máquina8,17,18. O DNA materno-fetal foi submetido à análise de duas regiões genômicas, uma comum para ambos os sexos (beta-globina) e outra específica de uma região do cromossomo Y (DYS-14). A reação da betaglobina serve como controle de amplificação e evita resultado falso-negativo devido a inibidores da reação de PCR. Já a reação com DYS-14 amplifica uma região de 147 pares de bases quando o DNA fetal é do sexo masculino. Quando o sexo fetal feminino é diagnosticado, ocorre a amplificação da região controle (beta-globina) e não ocorre o sinal de amplificação da região do cromossomo Y, ou seja, o diagnóstico é feito por exclusão do sexo masculino. No caso de diagnóstico do feto masculino, obrigatoriamente as duas regiões mostram amplificação. Para maior segurança e eficiência, as duas regiões foram analisadas em reações separadas e em duplicata. Só foram diagnosticados como fetos masculinos quando foi emitido sinal em ambas as duplicatas. Além disso, em toda reação realizada, utilizam-se dois controles positivos (DNA de gestação de feto do sexo masculino), dois controles negativos (DNA de feto do sexo feminino), além do NTC (no template control), que é utilizado para saber se houve contaminação em algum dos reagentes durante o procedimento da reação. O tempo médio para realizar a metodologia é de aproximadamente três horas.
 
Resultados
Foram realizados 79 exames de DNA fetal do plasma materno de 52 gestantes. As 5 pacientes que evoluíram para aborto foram excluídas, uma vez que não houve meios de se confirmar o sexo fetal. A taxa de acerto variou de acordo com a idade gestacional (Tabela 1), porém, em todos os exames cujo resultado indicou feto do sexo masculino não houve falha diagnóstica. Em apenas três dos 79 exames ocorreu discordância no diagnóstico do sexo fetal. Em todas as ocasiões, os exames foram rotulados como falso-negativos, desde que o resultado identificou sexo feminino quando na verdade o feto era do sexo masculino. Os exames foram repetidos em aproximadamente 15% dos casos pelo fato de os resultados terem sido inconclusivos.
Tabela 1 – Correlação do sexo fetal com a idade gestacional e índice de acerto.

VPN – Valor preditivo negativo.
VPP – Valor preditivo positivo.
Na 5ª semana de gestação foram realizados 30 exames, dos quais três evoluíram para aborto, e em dois exames os resultados foram discordantes, gerando índice de acerto de 92,6% (25 em 27 casos), conferindo sensibilidade de 87% (IC 95%; 0,61-0,98) e valor preditivo negativo de 0,84 (IC 95%; 0,54-0,98). Na 6º semana de gestação, dois dos 25 exames evoluíram para aborto e apenas um dos 23 exames foi discordante, determinando porcentagem de acerto de 95,6%, sensibilidade de 92% (IC 95%; 0,66-0,99) e valor preditivo negativo de 90% (IC 95%; 0,55-0,99 casos). Podemos destacar que todos os exames coletados a partir da 7ª semana tiveram seus resultados confirmados pela ultra-sonografia (29 de 29). Além disso, independente da idade gestacional, a especificidade do exame foi de 100%, gerando valor preditivo positivo de 100%.
 
Discussão
Os resultados do presente estudo coincidem com os da literatura, que mostram índices de acerto da técnica superior a 97% quando o exame é realizado a partir da 7ª semana de gestação13. Neste artigo, em que foram avaliadas 302 gestantes com idade gestacional entre 7 e 16 semanas, e se usou a mesma seqüência genômica utilizada nesse trabalho (DYS-14), foi encontrado índice de acerto para o sexo masculino de 97,2% (139 de 143 gestantes). O motivo pelo qual não se detectou o fragmento do cromossomo Y no plasma dessas quatro gestantes que apresentavam fetos do sexo masculino ainda é obscuro. Sabe-se que conforme evolui a idade gestacional, a concentração de DNA fetal no sangue materno aumenta8. Portanto, quanto maior a idade gestacional, maior a sensibilidade e mais fácil seria diagnosticar o sexo fetal. Entretanto, importantes oscilações nas concentrações de DNA fetal durante a gestação não podem ser excluídas. A novidade desse trabalho é a possibilidade de se detectar o sexo fetal a partir da 5ª semana de gestação com grande margem de confiança, uma vez que os estudos anteriores descritos estabeleceram a sétima semana como o tempo mínimo para a determinação do sexo fetal. Apenas um trabalho avaliou plasma de gestantes na 5ª semana de gestação, porém com amostra de apenas dois testes e índice de acerto de 50%19. Outra peculiaridade é o fato de que todas as gestantes que participaram desse estudo engravidaram por meio de fertilização in vitro (FIV). Tal fato confere maior precisão na idade gestacional. Atualmente sabe-se que as pacientes que engravidam naturalmente ou por FIV apresentam a mesma concentração de DNA fetal circulante no plasma20. Entre os casos em que não houve concordância do resultado do exame com o sexo fetal, o plasma havia sido coletado com idade gestacional precoce (5ª e 6ª semanas), o que nos leva a crer que a quantidade de DNA fetal circulante no sangue materno era insuficiente para a detecção. Além disso, o diagnóstico do sexo fetal correto foi possível com o uso de novo exame em idade gestacional mais avançada. Além da possível correlação entre a concentração do DNA fetal no sangue materno e a presença de aneuploidias fetais, o aumento da concentração do DNA fetal poderia também estar relacionado com distúrbios como pré-eclampsia, hiperêmese gravídica e algumas doenças relacionadas com a placenta17,18-21. Nossos dados preliminares de quantificação do cromossomo Y na 5ª e 6ª semanas de gestação mostram que a média é de menos de 10 cópias genômicas por mililitro (mL) de plasma, ou seja, está sendo detectada uma única cópia por reação, mostrando a sensibilidade do método aplicado. A definição do sexo fetal pode ser muito útil para o manejo das doenças genéticas ligadas ao cromossomo X, como é o caso, por exemplo, da síndrome do X-frágil e hemofilia. O diagnóstico precoce do sexo fetal pode ajudar principalmente na ansiedade dos pais que estão sob um risco genético reprodutivo. Dessa mesma forma, o exame pode ser ferramenta valiosa nas clínicas de reprodução assistida para obtenção do diagnóstico genético pré-implantação de embriões com doenças ligadas ao sexo. Precocemente (5ª semana), pode-se confirmar o sexo do feto, não havendo a necessidade da realização de exame invasivo como é a coleta de vilo (11ª semana) ou líquido amniótico (16ª semana). Outra utilidade do exame é o caso de risco de recorrência de hiperplasia congênita de supra-renal quando se usa corticosteroidoterapia como esquema terapêutico profilático logo no inicio da gestação para prevenir a possível virilização dos fetos femininos afetados. Em fetos do sexo masculino, não há necessidade de tratamento, evitando-se assim, o uso desnecessário da medicação que pode gerar efeitos colaterais para a gestante16,21. Em conclusão, o diagnóstico do sexo fetal a partir da 5ª semana de gestação pela técnica de PCR em tempo real apresenta boa sensibilidade e excelente especificidade. Entretanto, nos casos em que o resultado foi do sexo feminino, mas com a idade da gestação entre 5ª e a 6ª semana, recomenda-se que o exame seja repetido da 7ª semana em diante para uma maior precisão diagnóstica.
 
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